荧光定量pcr是( realtime fluores-cence quantitative pcr，rtfq pcr) 是1996 年由美国applied biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

原理

pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在dna任意一条单链上;pcr扩增时，taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。

荧光量化pcr原理

应用领域

tl988型实时荧光定量pcr仪应用领域

临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。 动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、cdc、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

荧光定量pcr应用前景及展望

实时荧光定量pcr的出现,极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，荧光定量pcr在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔，令人欣喜。尽管如此我们也应清晰认识到，目前fq-pcr技术在我国各个研究领域的应用并不多见，这就需要我国学者迎头赶上，使fq-pcr技术更充分地推广，以推动研究工作的快速发展。[1]

荧光定量pcr操作步骤

实验步骤：

1 样品rna的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的trizol试剂的60%。 ③rna沉淀 将水相上层转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的rna，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④rna清洗 移去上清液，每1mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用depch2o配制），清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤rna干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解rna沉淀 溶解rna时，先加入无rna酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。

2 rna质量检测

1）紫外吸收法测定 先用稀释用的te溶液将分光光度计调零。然后取少量rna溶液用te稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 a260下读值为1表示40 μg rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： rna溶于40 μl depc水中，取5ul，1:100稀释至495μl的te中，测得a260 = 0.21 rna 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品rna为35 μl，剩余rna总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× mops电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 m)。 10×mops电泳缓冲液 浓度 成分 0.4m mops，ph 7.0 0.1m 乙酸钠 0.01m edta 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×mops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ②准备rna样品 取3μgrna，加3倍体积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 ③电泳 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6v/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。 ④紫外透射光下观察并拍照 28s和18s核糖体rna的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提rna的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的rna（trna和5s核糖体rna）组成。在18s和28s核糖体带之间可以看到一片弥散的eb染色物质，可能是由mrna和其它异型rna组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3 样品cdna合成

①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dntp 0.1μl 5 逆转录酶mmlv 0.5μl 6 depc水 5μl 7 rna模版 2μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ②混合液在加入逆转录酶mmlv 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。 ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cdna溶液，保存于-80℃待用。

4 梯度稀释的标准品及待测样品

管家基因（β-actin）实时定量pcr ①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 ②反应体系如下： 标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物f 0.5μl 3 阳性模板下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 阳性模板dna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物f 0.5μl 3 内参照下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 待测样品cdna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的模板

①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cdna模板进行pcr反应。 反应体系： 序号 反应物 剂量 1 10× pcr缓冲液 2.5 ul 2 mgcl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物f 0.5 ul 4 下游引物r 0.5 ul 5 dntp混合液 3 ul 6 taq聚合酶 1 ul 7 cdna 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 35个pcr循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72oc延伸5分钟。 ②pcr产物与 dna ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。 ③将pcr产物进行10倍梯度稀释: 将pcr产物进行10倍梯度稀释: 设定pcr产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6 待测样品的待测基因实时定量pcr

①所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。 体系配置如下： 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dntp 1ul 5 taq聚合酶 2ul 6 待测样品cdna 5ul 7 ddh2o 30ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ②将配制好的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

7 实时定量pcr使用引物列表

引物设计软件：primer premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发dna 聚合反应(即错配)。

8 电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行realtime pcr反应。pcr产物与 dna ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，goldview?染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。